IHSLab BET

Uji Endotoksin Bakteri (BET)

Lingkup

Uji Endotoksin Bakteri (BET) juga dikenal sebagai uji Limulus Amoebocyte Lysate (LAL).

Parameter Bakteriologi

Uji Endotoksin Bakteri (BET) juga dikenal sebagai uji Limulus Amoebocyte Lysate (LAL).

Rasional

Pirogen adalah agen penyebab demam, dan endotoksin adalah jenis pirogen. Endotoksin adalah kompleks lemak-gula (lipopolisakarida) yang larut dalam air, stabil terhadap panas, dan terdapat di membran luar bakteri Gram-negatif seperti E. coli. Lipopolisakarida (LPS) ini merupakan komponen utama dinding sel bakteri Gram-negatif dan penting untuk kelangsungan hidup mereka. Pelepasan LPS dari bakteri terjadi setelah kematian dan lisis sel, dan bersifat beracun. Zat beracun yang dilepaskan oleh sel bakteri hidup ke lingkungannya disebut eksotoksin. Sebaliknya, zat beracun yang ada dalam sel bakteri hidup tetapi sebagian besar dilepaskan setelah kematian dan lisis disebut endotoksin. Dengan demikian, kompleks lemak-gula yang dilepaskan setelah lisis bakteri Gram-negatif disebut endotoksin. Endotoksin umum ditemukan di mana-mana di lingkungan kita. Perebusan maupun filtrasi biasa tidak dapat menghilangkan endotoksin.

Ketika koloni bakteri Gram-negatif mati, sejumlah besar endotoksin dilepaskan ke lingkungan dan masuk ke dalam air. Karena flora usus kita mengandung bakteri Gram-negatif, endotoksin juga diproduksi di dalam usus kita akibat kematian koloni tersebut. Namun, mukosa usus mencegah masuknya endotoksin ke aliran darah. Jika endotoksin bersentuhan dengan darah, tergantung pada jumlahnya, mereka menimbulkan berbagai respons tubuh mulai dari demam hingga konsekuensi yang lebih serius seperti syok septik dan kematian pada kasus ekstrem. Risiko endotoksin bersentuhan dengan darah muncul melalui suntikan ke aliran darah, paparan darah melalui membran semipermeabel seperti pada hemodialisis, dll. Efek endotoksin terkait dengan konsentrasinya dan volume cairan terkontaminasi yang bersentuhan dengan darah.

Air adalah salah satu komoditas utama yang digunakan oleh industri farmasi. Berbagai tingkat kualitas air diperlukan untuk berbagai penggunaan farmasi. Ini termasuk air minum, air untuk pembuatan ekstrak, air murni, dan air untuk injeksi (WFI). Air minum mungkin memadai untuk sintesis zat antara (obat curah) dari zat aktif dan pembuatan entitas kimia yang tidak memerlukan air bebas pirogen. Pirogen mungkin tidak menjadi masalah dalam kasus air untuk pembuatan ekstrak tertentu. Air minum mungkin memadai untuk pembersihan dan pembilasan awal peralatan dan wadah farmasi. Namun, pembilasan akhir memerlukan air murni atau air untuk injeksi sesuai dengan berbagai zat aktif. Sebagian besar produk obat steril, termasuk vaksin dan sediaan parenteral, memerlukan air untuk injeksi. Beberapa produk obat steril seperti obat tetes mata, sediaan telinga, hidung, dan kulit dapat menggunakan air murni. Semua produk obat non-steril harus menggunakan air murni. Baik WFI maupun Air Murni adalah produk curah, sebagian besar digunakan sebagai bahan baku di industri farmasi. Produk air kemasan untuk injeksi yang dijual di apotek ritel sebenarnya disebut dalam farmakope sebagai 'air steril untuk injeksi'. WFI harus bebas pirogen dan steril tanpa kemungkinan pertumbuhan kembali mikroorganisme. Itulah sebabnya sistem WFI dirancang untuk menjaga air produk pada suhu yang lebih tinggi. Air murni biasanya dipertahankan pada suhu kamar dan mungkin tidak steril karena ada beberapa kemungkinan pertumbuhan kembali mikroba. Toleransi endotoksin tergantung pada tujuan penggunaan. Misalnya, air murni untuk dialisis harus bebas pirogen (EMA, 2018, USFDA, 1986).

IS 17646 (Bagian 3) : 2021 / ISO 23500 bagian 3 : 2019, yang memberikan persyaratan air untuk hemodialisis dan terapi terkait, menetapkan bahwa air dialisis idealnya harus bebas dari pirogen dan kadar endotoksin bakteri harus < 0,25 EU/ml.

Secara tradisional, keberadaan endotoksin diuji menggunakan uji pirogen pada kelinci. Dalam metode ini, air yang akan diuji disuntikkan melalui vena ke telinga kelinci dan suhu hewan diamati sesuai protokol yang ditentukan. Uji pirogen kelinci memerlukan setidaknya 3 kelinci, pencatatan suhu awal dan setiap setengah jam selama 3 jam, dan dalam kasus hasil yang tidak dapat ditentukan, uji ulang dengan 5 kelinci tambahan. Selain durasi yang panjang dan prosedur yang rumit, uji pirogen kelinci memiliki beberapa keterbatasan lain. Ini adalah uji lulus/gagal, untuk menentukan apakah cairan yang disuntikkan mengandung pirogen yang substansial atau tidak. Konsentrasi endotoksin tidak dapat diukur.

Penemuan pada tahun 1960-an bahwa endotoksin bakteri menggumpalkan darah kepiting tapal kuda (Limulus polyphemus) membuka jalan untuk pengembangan uji endotoksin bakteri yang lebih spesifik dan kuantitatif, menggunakan Limulus amebocyte lysate (LAL) sebagai reagen (ERDG, 2018). Ada dua subfamili kepiting tapal kuda, yaitu: (a) Limulinae, termasuk Limulus polyphemus yang ditemukan di pantai timur Amerika Utara, dan (b) Tachypleinae yang ditemukan di sepanjang pantai selatan dan tenggara Asia dari Teluk Benggala hingga Laut China Selatan. Baik Tachypleus dan Limulus Amebocyte Lysate (TAL dan LAL) digunakan untuk uji endotoksin bakteri. Ada empat metode dasar uji endotoksin menggunakan reagen LAL atau TAL, yaitu: (i) gel-clot; (ii) turbidimetrik (spektrofotometrik); (iii) kolorimetrik (protein Lowry); dan (iv) uji kromogenik.

Penemuan sistem imunologi kepiting tapal kuda, termasuk sel darah amoebosit dan faktor pembekuan darah di dalamnya, mengubah cara produk diuji untuk endotoksin. Darah kepiting tapal kuda berwarna biru karena protein pembawa oksigen berbasis tembaga yang disebut hemosianin. Uji Frederik Bang dan Jack Levin menggunakan sistem pembekuan darah untuk membentuk gel clot di tabung reaksi ketika endotoksin ada dalam sampel uji. Penelitian pada kepiting tapal kuda menunjukkan bahwa darah mereka sangat sensitif terhadap endotoksin, yang merupakan komponen bakteri Gram-negatif seperti E. coli. Pada tahun 1960-an (lihat garis waktu), Frederik Bang dan Jack Levin mengembangkan uji dari darah Limulus polyphemus yang mendeteksi keberadaan endotoksin. Uji ini, berdasarkan fakta bahwa darah kepiting tapal kuda membeku atau menggumpal ketika bersentuhan dengan endotoksin, disebut uji Limulus amebocyte lysate (LAL) dan dikomersialisasikan di Amerika Serikat pada tahun 1970-an. Di Asia, ada uji serupa yang disebut TAL yang mengambil nama dari spesies kepiting Asia, yaitu Tachypleus tridentatus.

Badan Pengawas Obat dan Makanan Amerika Serikat (USFDA) telah mengakui manfaat Uji Endotoksin Bakteri (BET) berbasis Limulus Amebocyte Lysate (LAL), khususnya dalam hal sensitivitas, reprodusibilitas, cakupan, dan kesederhanaan. Pada tahun 1984, lima produk air dari United States Pharmacopeia (USP) diberi batas endotoksin bakteri tertentu. Air untuk Injeksi, Air Steril untuk Injeksi, dan Air Steril untuk Irigasi memiliki batas endotoksin yang diizinkan sebesar 0,25 Unit Endotoksin (EU)/ml. (EU = Satuan pengukuran aktivitas endotoksin). Namun, Air Bakteriostatik untuk Injeksi dan Air Steril untuk Inhalasi diberi batas endotoksin bakteri yang sedikit lebih tinggi, yaitu 0,5 EU/ml (USFDA, 1985). Farmakope India mengakui BET sebagai metode yang valid untuk menguji status bebas pirogen produk farmasi.

Laboratorium mengikuti metode gel-clot untuk uji endotoksin bakteri (BET) menggunakan reagen LAL/TAL.

Pengumpulan, Penyimpanan, dan Transportasi Sampel

Metode pengambilan sampel mengacu pada IS 1622 : 1981 untuk uji bakteriologis. Sampel harus mewakili air yang akan diuji dan dikumpulkan dengan hati-hati untuk memastikan tidak terjadi kontaminasi pada saat pengumpulan atau sebelum pemeriksaan oleh laboratorium.

Langkah 1: Siapkan tabung non-pirogenik

Anda memerlukan tabung non-pirogenik steril (bebas endotoksin) (NPT), yang tersedia dari laboratorium.

Langkah 2: Identifikasi titik dan waktu pengambilan sampel

Sampel harus dikumpulkan di mana mesin dialisis terhubung ke loop distribusi air, dan dari titik sampel di segmen distal loop atau di mana air tersebut masuk ke tangki pencampur. Oleh karena itu, identifikasikan keran yang nyaman dari jalur distribusi air dialisis di dalam ruang dialisis. Karena akses ke ruang dialisis biasanya terbatas, mintalah izin dan ikuti protokol untuk masuk ke ruang dialisis. Alternatifnya, mintalah perawat dialisis atau petugas kesehatan lain untuk membantu mengumpulkan sampel dari salah satu keran distribusi air dialisis yang tersedia di dalam ruang dialisis. Pilih hari ketika laboratorium buka dan kumpulkan pada pagi hari, sehingga sampel dapat sampai ke laboratorium pada siang hari dan pemrosesan dilakukan pada hari yang sama.

Langkah 3: Kumpulkan sampel

Sebelum memasuki area dialisis, cuci kedua tangan dengan sabun dan air, lap dengan handuk bersih dan biarkan kering. Kenakan penutup sepatu sekali pakai dan sarung tangan steril. Beri label pada tabung pengumpulan sampel, tetapi jangan dibuka pada tahap ini. Siapkan kompres es. Bilas keran pengeluaran dengan mengalirkan air ke dalam ember selama, misalnya 2-3 menit. Jangan menyentuh aliran dari pipa pengeluaran. Pegang tabung dengan satu tangan, buka dan pegang tutupnya dengan tangan lain, hindari menyentuh bagian dalam tutup. Tempatkan tabung yang terbuka di bawah keran tanpa kontak langsung. Saat tabung hampir penuh, segera angkat dari aliran air dan pasang tutupnya dengan rapat. Bungkus tabung dengan kantong polietilen steril berwarna gelap (Anda dapat menggunakan sarung tangan steril), dan ikat bersama dengan kompres es dalam tas jinjing untuk transportasi ke laboratorium.

Langkah 4: Segera bawa ke laboratorium. Jangan simpan!

Informasi tentang Sumber, Konteks, Penggunaan yang Dimaksud, dan Kekhawatiran

Berikan sebanyak mungkin detail tentang titik pengambilan sampel. Sebutkan uji sebelumnya atau tanggal pengambilan sampel terakhir. Kumpulkan detail mengenai sumber air umpan, sampel DRF&DLB simultan jika ada, tanggal terakhir desinfeksi sistem distribusi air dialisis, dan jenis sistem distribusi air dialisis.

Dua jenis sistem distribusi air dialisis yang umum, yaitu sistem umpan langsung dan tidak langsung. Dalam sistem distribusi air umpan langsung, keluaran dari unit RO melewati filter endotoksin dan terhubung langsung ke loop distribusi yang mengirimkan air murni ke berbagai titik penggunaan di ruang dialisis. Air murni yang tidak terpakai dikembalikan sebagai air umpan dan didaur ulang melalui unit RO. Dalam sistem distribusi air tidak langsung, air murni dari unit RO disimpan dalam tangki penampung yang dirancang khusus dilengkapi dengan perangkat kontrol level air. Perangkat ini berinteraksi dengan unit RO, mematikannya dan menyalakannya sesuai kebutuhan dan menjaga level air yang sesuai di tangki penampung, sehingga tangki tidak kering atau kelebihan air. Air murni di tangki penampung ditekan kembali oleh pompa pendorong distribusi, yang mengarahkan air murni dari tangki melalui filter endotoksin sebelum mengalir ke loop distribusi, menyediakan air murni ke berbagai titik penggunaan di ruang dialisis. Sistem distribusi air murni tidak langsung mengembalikan air murni yang tidak terpakai kembali ke tangki penampung (Kasparek dan Rodriguez, 2015).

Metode Uji & Durasi

Laporan akan tersedia dalam 1 hari.

Referensi

• USFDA. Bacterial Endotoxins / Pyrogens. Silver Spring, MD, USA: United States Food & Drug Administration (USFDA); 1985 Mar 20; Inspection Technical Guides (ITG):40.
• ERDG. 2018. Endotoxin Timeline. Little Creek, Dover, DE, USA: Ecological Research & Development Group (ERDG).
• IS 1622: 1981. Indian Standard Methods of Sampling and Microbiological Examination of Water. New Delhi: Bureau of Indian Standard (BIS); Indian Standard, IS1622 - 1981, Reaffirmed 1996, Amended 2003.
• IS 17646 (Part 3) : 2021 Preparation and quality management of fluids for haemodialysis and related therapies Part 3 Water for haemodialysis and related therapies. Identical under dual numbering (ISO 23500-3 : 2019).
• ISO 23500-3. 2019. Preparation and quality management of fluids for haemodialysis and related therapies — Part 3: Water for haemodialysis and related therapies. Geneva, Switzerland: International Standards Organization (ISO); 2019 Feb; ISO 23500-3:2019.
• Kasparek Ted and Rodriguez Oscar E. What Medical Directors Need to Know about Dialysis Facility Water Management. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 2015 Jun 5; 10(6):1061-1071.
• USFDA. Water for Pharmaceutical Use. Silver Spring, MD, USA: United States Food & Drug Administration (USFDA); 1986 Dec 31; Inspection Technical Guides (ITG), (ITG Subject: Water for Pharmaceutical use).
• EMA. Guideline on the quality of water for pharmaceutical use. Draft. London, UK: European Medicines Agency (EMA); 2018 Nov 13; EMA/CHMP/CVMP/QWP/496873/2018.