Analisis Profil Termal Skala Kecil dan Koagregasi Proteom untuk Target Obat dan Analisis Interaksi Protein

Abstrak

Profil termal proteom (TPP) adalah teknik eksperimental yang menggabungkan uji pergeseran termal seluler (CETSA) dengan spektrometri massa protein kuantitatif (MS), yang mengidentifikasi interaksi obat dan bahan kimia dengan protein endogen. Profil koagregasi kedekatan termal (TPCA) memperluas TPP untuk mempelajari dinamika intraseluler kompleks protein. Dalam TPP dan TPCA, sampel dikenakan beberapa suhu denaturasi, masing-masing membutuhkan lebih dari 100 μg protein, yang membatasi aplikasinya untuk sel langka dan sampel klinis berharga. Kami mengembangkan alur kerja yang disebut STASIS (profil termal skala kecil dan analisis koagregasi dengan SISPROT) yang mengurangi kebutuhan protein hingga serendah 1 μg per suhu. Hal ini dicapai dengan pemanasan dan sentrifugasi menggunakan tabung PCR yang sama, memproses sampel dengan teknologi SISPROT (teknologi proteomik berbasis spintip yang sederhana dan terintegrasi), dan fraksinasi manual berbasis tip dari peptida berlabel TMT. Kami mengevaluasi alur kerja STASIS dengan jumlah protein awal 10, 5, dan 1 μg per suhu sebelum pemanasan, mengidentifikasi antara 4000 dan 5000 protein dengan waktu akuisisi 6 jam. Yang penting, kami mengamati korelasi tinggi dalam Tm protein dengan perbedaan minimal dalam kinerja TPCA untuk memprediksi kompleks protein. Selain itu, STASIS dapat mengidentifikasi target metotreksat dan panobinostat dengan presisi tinggi dengan 1 μg protein per suhu. Kesimpulannya, STASIS adalah teknik yang kuat dan hemat biaya untuk dekonsolidasi target dan memperluas TPCA ke sel primer langka dan sampel klinis berharga untuk analisis kompleks protein.