Ekspresi T-bet Meningkat pada Penyakit Behçet Aktif

Abstrak

Tujuan: Menyelidiki ekspresi mRNA dan protein T-bet pada sel mononuklear darah perifer (PBMC) pada pasien penyakit Behçet dengan uveitis aktif.

Metode: Sampel darah diambil dari 24 pasien penyakit Behçet yang memiliki uveitis aktif dan 16 individu sehat. PBMC dianalisis untuk ekspresi mRNA dan protein T-bet menggunakan reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) semikuantitatif dan western blot. Produk PCR diurutkan. Untuk menentukan pengaruh aktivasi terhadap ekspresi T-bet, PBMC yang distimulasi fitohemaglutinin (PHA) dari setiap sampel juga dievaluasi untuk ekspresi mRNA dan protein T-bet.

Hasil: Akumulasi mRNA T-bet yang meningkat secara signifikan terdeteksi pada sampel dari pasien penyakit Behçet aktif dibandingkan dengan kontrol. Pita 62 kDa terdeteksi pada pasien penyakit Behçet aktif, tetapi tidak pada kontrol. Tidak ada perbedaan yang ditemukan antara pasien penyakit Behçet dengan uveitis aktif dan kontrol normal mengenai ekspresi mRNA T-bet atau proteinnya setelah stimulasi dengan PHA selama 72 jam.

Kesimpulan: Penyakit Behçet berhubungan dengan peningkatan ekspresi T-bet, yang mendukung peran subset sel T Th1 dalam patogenesis penyakit ini.

Kata kunci: penyakit Behçet, T-bet, sel Th1, manusia

Pendahuluan

Keseimbangan antara sel Th1 dan Th2 sangat penting untuk homeostasis imun dalam tubuh. Produksi berlebihan sitokin Th1 telah dikaitkan dengan reaksi hipersensitivitas tipe lambat dan penyakit autoimun. Banyak penelitian telah dilakukan untuk menyelidiki faktor-faktor yang terlibat dalam regulasi sel Th1. T-bet, juga dikenal sebagai ekspresi T-box pada sel T, adalah faktor transkripsi T-box spesifik Th1 yang baru diidentifikasi dan diekspresikan secara selektif pada sel Th1. Faktor ini mampu menargetkan remodeling kromatin gen IFN-γ pada sel Th1 dan memiliki kemampuan unik untuk mengarahkan kembali sel Th2 yang terpolarisasi penuh menjadi sel Th1, sebagaimana dibuktikan oleh induksi simultan IFN-γ dan represi IL-4 dan IL-5.

Penyakit Behçet adalah penyakit inflamasi sistemik kronis dengan etiologi yang tidak diketahui. Sejumlah temuan klinis dan laboratorium menunjukkan respons imun Th1 yang sangat terpolarisasi pada penyakit Behçet. Belum jelas apakah protein T-bet terlibat dalam patogenesis yang dimediasi Th1 pada penyakit Behçet pada tingkat transkripsi. Oleh karena itu, penelitian ini dirancang untuk menyelidiki ekspresi T-bet pada penyakit Behçet menggunakan RT-PCR dan western blot.

Pasien dan Metode

Pasien

Dua puluh empat pasien penyakit Behçet (11 pria dan 13 wanita) yang memiliki uveitis aktif dilibatkan dalam penelitian ini. Usia rata-rata pasien adalah 36,5 tahun. Diagnosis penyakit Behçet didasarkan pada kriteria yang dirancang oleh International Study Group for Behçet's Disease. Semua pasien menunjukkan uveitis berulang dan peradangan intraokular aktif terlihat saat pengambilan sampel dilakukan sebelum kunjungan ke pusat mata kami. Enam belas individu sehat (tujuh pria dan sembilan wanita) bertindak sebagai kontrol dengan usia rata-rata 35,4 tahun. Temuan okular umum pada pasien penyakit Behçet ini adalah uveitis anterior non-granulomatosa (80%), vaskulitis retina (95,8%), dan retinitis (100%). Manifestasi ekstraokular umum adalah stomatitis aftosa berulang (100%), lesi kulit multiformis (91,7%), ulkus genital berulang (54%), dan arthritis (50%). Semua pasien pernah diobati secara intermiten dengan steroid sistemik, tetapi tidak ada agen imunosupresif yang digunakan sebelum pengumpulan sampel darah ini. Semua peserta diberi informasi tentang penelitian dan setuju untuk berpartisipasi serta mengizinkan pengambilan darah tambahan untuk tujuan penelitian.

Isolasi dan kultur PBMC

Sampel darah yang diheparinisasi (8 ml) diperoleh dari pasien dan individu sehat, dan isolasi sel mononuklear darah perifer (PBMC) dilakukan dengan sentrifugasi gradien densitas. PBMC yang diperoleh dari setiap sampel dibagi menjadi dua alikuot: satu langsung dianalisis untuk T-bet pada tingkat mRNA dan protein, dan yang lainnya untuk analisis T-bet setelah aktivasi PBMC tersebut dengan PHA (Sigma, MO, USA) pada konsentrasi 5 μg/ml. Untuk tujuan ini, PBMC dikultur dengan PHA selama 72 jam. Sel dikumpulkan setelah kultur dan digunakan untuk analisis T-bet menggunakan prosedur berikut.

Ekstraksi RNA dan RT-PCR

Total RNA diekstraksi dari PBMC dengan atau tanpa stimulasi fitohemaglutinin (PHA) menggunakan reagen Trizol (Gibco Life Technologies, CA, USA) sesuai instruksi pabrik. Sampel yang diperoleh diukur dengan absorbansi pada 260 nm. Integritas RNA diperiksa dengan elektroforesis pada gel agarosa 1,2%. cDNA PBMC disintesis dan diamplifikasi dalam Sistem ThermoScript RT-PCR (Gibco Life Technologies, CA, USA) dalam kondisi yang dinyatakan dalam protokol pabrik. Setelah kondisi reaksi PCR dioptimalkan, reaksi PCR dilakukan dalam volume total 50 μl dengan adanya 2U Taq DNA polimerase, 200 μmol/l dNTP, dan 0,5 μmol/l primer 5’ dan 3’. Reaksi diinkubasi dalam sistem GeneAmpPCR 9700 (PE Biosystems, CA, USA). Prosedur PCR meliputi denaturasi selama 1 menit pada 94°C, aneling selama 1 menit pada 55°C, dan ekstensi selama 1 menit 15 detik pada 72°C. Primer PCR yang digunakan adalah sebagai berikut: T-bet, sense: 5’-GAGGGTCGCGCTCAACAAC-3’; antisense: 5’-GGATGCTGGTGTCAACA GATG-3’; β aktin, sense: 5’GCCATCCTGCGTCTG-3’; antisense: 5’GGGGCATCGGAACCGCT-3’. Untuk mengecualikan amplifikasi DNA genom yang mengotori sampel, eksperimen juga dilakukan menggunakan RNA sebagai substrat untuk uji PCR. Densitometri menganalisis pita pada gel setelah elektroforesis gel agarosa. Produk yang diamplifikasi dimurnikan menggunakan QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen Company, Hilden, Germany) sesuai protokol pabrik. Produk PCR T-bet diurutkan pada Sistem Pengurutan DNA Model 377 Applied Biosystems.

Ekstraksi protein dan analisis western blot

Total protein diekstraksi dari PBMC yang baru diperoleh dan yang distimulasi dengan PHA menggunakan buffer lisis (62,5 mM TRIS-HCl pH 6,8, 2% SDS, 10% gliserol, 50 mM DTT, 2 mM PMSF, 10 μg/ml aprotinin). Supernatan dikumpulkan, disentrifugasi pada 4000 g selama 40 menit pada 4°C dan disimpan pada −70°C sampai diuji. Untuk deteksi T-bet, 20 μg total lisat protein dipisahkan pada gel SDS-poliakrilamida 12% dan secara elektroforetik ditransfer ke membran PVDF (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) selama 12 jam pada 4°C. Protein T-bet dideteksi setelah inkubasi dengan anti-T-bet (pengenceran akhir 1:500) (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) dan inkubasi selanjutnya dengan IgG kambing anti-kelinci terkonjugasi HRP peroksidase (pengenceran akhir 1:2000) (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Reaksi dideteksi dengan kit deteksi Chemiluminescence (Cell Signalling Technology, Beverly, USA).

Analisis statistik

Analisis statistik dilakukan menggunakan uji t untuk dua sampel independen, di mana p<0,05 dianggap signifikan.

Hasil

Ekspresi mRNA T-bet pada pasien penyakit Behçet dan kontrol

Produk PCR yang diperoleh diurutkan dan menunjukkan homologi 99,6%. Menggunakan kondisi yang dioptimalkan, peningkatan tingkat transkrip mRNA T-bet diamati pada semua pasien yang diuji. Rasio rata-rata tingkat mRNA T-bet terhadap β aktin adalah 0,86 pada pasien sedangkan pada kontrol adalah 0,3. Tidak ada korelasi signifikan dari rasio ini dengan keparahan klinis uveitis. Perbedaan rasio tingkat mRNA T-bet terhadap β aktin antara pasien dan kontrol signifikan secara statistik (p<0,001).

Gambar 1: Analisis RT-PCR T-bet dan β aktin pada PBMC dari delapan pasien penyakit Behçet aktif (jalur 1–8) dan delapan kontrol normal (jalur a–h). Satu eksperimen representatif dari 12 pasien penyakit Behçet aktif dan 10 kontrol yang diteliti secara total disajikan. Pasien lain menunjukkan pola respons yang serupa. Upregulasi ekspresi mRNA T-bet terdeteksi pada penyakit Behçet aktif.

Untuk mengevaluasi pengaruh aktivasi PBMC terhadap mRNA T-bet, ekspresinya juga diselidiki setelah merangsang PBMC dengan PHA baik pada pasien maupun kontrol. Ekspresi mRNA T-bet meningkat secara nyata pada kontrol setelah stimulasi. Rasio nilai OD signifikan lebih tinggi setelah stimulasi (rata-rata 0,8) dibandingkan sebelum stimulasi (rata-rata 0,3) (p<0,001). Tidak terduga, ekspresi mRNA T-bet pada PBMC setelah stimulasi PHA pada pasien (rata-rata 0,87) tidak meningkat dibandingkan sebelum stimulasi (rata-rata 0,86). Tidak ada perbedaan antara pasien dan kontrol mengenai rasio tingkat mRNA T-bet terhadap β aktin setelah stimulasi dengan PHA.

Gambar 2: Analisis RT-PCR T-bet dan β aktin pada PBMC yang distimulasi PHA dari empat kontrol normal (jalur 1–4) dan empat pasien penyakit Behçet aktif (jalur 5–8). Prosedur yang digunakan dalam eksperimen ini sama seperti yang tercantum pada Gambar 1.

Ekspresi protein T-bet pada pasien dan kontrol

Protein dengan ukuran molekul sekitar 62 kDa terdeteksi pada PBMC dari semua pasien penyakit Behçet. Namun, protein ini tidak terdeteksi pada kontrol. Setelah inkubasi PBMC dengan PHA, semua sampel, baik yang berasal dari pasien maupun kontrol, menunjukkan protein dengan berat molekul 62 kDa. Selain itu, analisis kualitatif menunjukkan bahwa ekspresi protein T-bet serupa antara pasien dan kontrol.

Gambar 3: Analisis western blot ekspresi protein T-bet pada PBMC dari pasien penyakit Behçet aktif dan kontrol normal. Protein 62 kDa terdeteksi pada semua sampel dari pasien penyakit Behçet (jalur 1–6), tetapi tidak pada kontrol normal (jalur 7, 8). Satu eksperimen representatif dari dua eksperimen independen ditampilkan.

Gambar 4: Ekspresi T-bet pada PBMC dari pasien penyakit Behçet dan kontrol normal. Setelah sel dikultur dengan PHA selama 72 jam, protein 62 kDa terdeteksi pada semua sampel yang diuji baik dari pasien penyakit Behçet (jalur 1–4) maupun dari kontrol normal (jalur 5–7). Satu eksperimen representatif dari dua eksperimen independen ditampilkan.

Diskusi

Dalam penelitian ini, peningkatan ekspresi T-bet yang nyata pada tingkat mRNA dan protein tercatat pada PBMC dari pasien penyakit Behçet dengan uveitis aktif dibandingkan dengan kontrol. Telah disarankan bahwa ekspresi T-bet meningkat pada sel T yang teraktivasi. Oleh karena itu, ekspresi T-bet baik pada tingkat mRNA maupun protein diharapkan mengalami upregulasi setelah aktivasi sel T dari kontrol. Eksperimen merangsang PBMC dari kontrol ini dengan PHA dan analisis mRNA dan protein T-bet memang menunjukkan peningkatan ekspresi T-bet, mengonfirmasi validitas teknik yang digunakan dalam penelitian dan secara de facto menunjukkan upregulated ekspresi T-bet pada pasien penyakit Behçet yang memiliki peradangan intraokular aktif.

Studi tentang ekspresi T-bet memiliki implikasi khusus mengingat peran regulasinya dalam polarisasi sel Th1. Sel Th1 yang meningkat secara numerik dan fungsional terlibat dalam perkembangan berbagai penyakit autoimun termasuk penyakit Behçet. Penelitian terbaru mengungkapkan bahwa polarisasi limfosit T menjadi subset efektor yang terdiferensiasi dikontrol secara ketat oleh berbagai faktor transkripsi. Telah ditunjukkan bahwa Stat1, Stat4, dan T-bet terlibat dalam regulasi dan polarisasi sel Th1 pada tingkat transkripsi. Telah ditetapkan bahwa protein Stat mungkin tidak penting dalam mengatur transkripsi gen IFN-γ. T-bet telah terbukti diekspresikan secara selektif pada sel Th1. Faktor ini memiliki peran sentral dalam perkembangan sel Th1 melalui pengaktifan program genetik Th1 dan represi sintesis sitokin sel Th2. Jelas bahwa T-bet adalah saklar utama untuk perkembangan sel Th1. Oleh karena itu, studi tentang T-bet dapat memberikan wawasan tentang mekanisme berbagai penyakit autoimun termasuk penyakit Behçet pada tingkat transkripsi.

Peningkatan ekspresi mRNA dan protein T-bet pada pasien penyakit Behçet aktif, seperti yang ditunjukkan dalam penelitian ini, sesuai dengan hasil yang dilaporkan sebelumnya. Studi telah mengungkapkan bahwa IFN-γ sangat penting dalam mengatur jalur jaringan sitokin IL-4, IL-10, dan IL-2 pada penyakit Behçet; kadar serum IL-2 dan IFN-γ yang tinggi juga telah diamati pada pasien ini. Hasil yang disajikan di sini, bersama dengan yang disebutkan di atas, dengan jelas menunjukkan bahwa aktivasi sel Th1 adalah fitur penting pada pasien penyakit Behçet yang memiliki uveitis aktif dan mungkin penting dalam patogenesis penyakit ini.

Studi tentang T-bet pada penyakit celiac (penyakit autoimun yang dimediasi Th1 lainnya) dan asma (penyakit yang dimediasi Th2) telah mengungkapkan hasil yang mirip dengan yang disajikan di sini. Salvati dkk. menemukan bahwa ekspresi T-bet meningkat pada mukosa yang meradang dari pasien penyakit celiac. Bertentangan dengan hasil di atas, sel T CD4+ yang mengekspresikan T-bet relatif lebih sedikit ditemukan di saluran napas pasien asma dibandingkan dengan kontrol. Hasil ini sesuai dengan konsep bahwa upregulasi T-bet berperan dalam perkembangan penyakit autoimun, dan downregulasinya terlibat dalam penyakit alergi.

Menarik untuk dicatat bahwa tidak ada perbedaan yang dapat diamati mengenai ekspresi mRNA dan protein T-bet pada pasien penyakit Behçet kami sebelum dan setelah stimulasi dengan PHA, meskipun perbedaan signifikan terdeteksi pada kontrol. Upregulasi T-bet pada pasien ini diharapkan mirip dengan yang terlihat pada kontrol. Hasil ini mungkin menunjukkan bahwa sejumlah besar sel Th1 yang teraktivasi sudah ada di PBMC pasien penyakit Behçet dengan peradangan intraokular aktif.

Studi kami memiliki beberapa keterbatasan. Kami tidak mengetahui ekspresi T-bet pada penyakit Behçet tidak aktif. Selain itu, akan menarik untuk menyelidiki apakah aktivasi Th1 tercermin oleh profil sitokin intraokular atau serum (misalnya, IFN-γ dan IL-4). Mengatasi masalah ini akan sangat meningkatkan pemahaman kita tentang patogenesis uveitis dan dapat berkontribusi secara substansial pada studi strategi pencegahan dan pengobatan uveitis.